مجله علوم پزشكي دانشگاه آزاد اسلامي دوره 26 شماره 2 تابستان 95 صفحات 69 تا 75 Original Article بقا و تكثير جزاير جدا شده پانكراسي موش بالغ در شرايط كشت آزمايشگاهي محمد نبيوني 1 الهام حويزي 2 آذر چاوشيان 3 سميه بهرام زاده 4 محمود هاشمي تبار 5 1 دانشيار گروه سلولي و مولكولي دانشكده علوم زيس ي ت دانشگاه خوارزمي تهران استاديار گروه زيست شناسي دانشكده علوم دانشگاه شهيد چمران اهواز 2 3 كارشناسي ارشد زيست شناسي سلولي و مولكولي دانشكده علوم زيس ي ت دانشگاه خوارزمي تهران 4 گروه زيست شناسي سلولي و مولكولي زيست شناسي سلولي تكويني دانشگاه علوم پزشكي جندي شاپور اهواز 5 دانشيار چكيده مركز تحقيقات سلولي و مولكولي دانشگاه علوم پزشكي جندي شاپور اهواز سابقه و هدف: پيشرفتهاي اخير در تمايز مستقيم سلولهاي بنيادي پانكراسي پيشنهاد دهنده پتانسيل جايگزيني پانكراس در بيماران ديابتي است اما اغلب پروتوكلهاي موجود پيچيده زمانبر و پرهزينه است بنابراين بايد به دنبال پرتوكلهاي ديگري بود. امروزه استفاده از كشت همزمان با جزاير پانكراسي روشي اميدبخش براي توليد سلولهاي بتا است بنابراين نيازمند نگهداري جزاير زنده براي دوره زماني گسترده هستيم. روش بررسي: جزاير پانكراسي جدا شده از موش به مدت 2 هفته در شرايط كشت آزمايشگاهي نگهداري و بقا تكثير و مورفولوژي آنها مورد بررسي قرار گرفت. جزاير پانكراسي از موش نر نژاد NMRI با روش تعديل شده Lacy and Kostianovsky و هضم آنزيمي با كلاژناز جدا شدند و براي تعيين ويژگيها به وسيله رنگ ديتيزون رنگ آميزي شدند. همچنين بقاي جزاير با روش MTT بررسي شد. يافتهها: نتايج ما نشان داد كه ميتوان جزاير پانكراسي موش بالغ را جدا كرده و حداقل به مدت يك هفته كشت داد بدون اينكه عملكرد فعال خود را از دست دهند. با گذشت يك هفته با توجه به كاهش بقا سلولي تعداد سلولهاي جزاير نيز كاهش پيدا كرد. هر چه مدت زمان كشت افزايش پيدا ميكرد از ميزان بقا و تعداد سلولها كاسته ميشد. نتيجهگيري: مي توان جزاير جدا شده را به صورت زنده و فعال در كشت همزمان مورد استفاده قرار داد. از آنجايي كه اين جزاير در سلول درماني در جهت درمان ديابت استفاده ميشود بررسي ميزان بقاي اين سلولها در شرايط محيط كشت ضروري به نظر ميرسد. واژگان كليدي: بقا تكثير جزاير پانكراسي كشت سلول.NMRI MTT مقدمه 1 پانكراس بالغ از لحاظ ظاهري و عملكردي داراي دو بخش مجزاي درونريز و برونريز است. بخش برونريز شامل سلولهاي مجرا و آسينار است كه 95-99 درصد پانكراس را تشكيل ميدهند و بخش مولد آنزيمهاي هاضم هستند كه هضم مواد غذايي را براي سهولت جذب در روده سرعت آدرس نويسنده مسي ول: اهواز دانشگاه علوم پزشكي جندي شاپور مركز تحقيقات سلولي و مولكولي محمود هاشمي تبار Hotmail.com) (email: Hashemi _ tabar @ تاريخ دريافت مقاله: 94/5/17 تاريخ پذيرش مقاله: 94/10/6 ميبخشند. بخش درونريز شامل جزاير لانگرهانس است كه تجمعات سلولي مشتق از آندودرم است و ما بين بخش برون ريز به صورت پراكنده وجود دارند. جزاير داراي 4 نوع سلول هستند كه هورمونهاي پپتيدي را ميسازند: سلولهاي بتا (انسولين) سلولهاي آلفا (گلوكاگون) سلولهاي گاما (سوماتواستاتين) و سلولهايPP (polypeptide)-pancreatic كه پلي پپتيد پانكراسي را توليد ميكنند. اختلال در بخش درونريز پانكراس موجب بيماري ديابت قندي (DM) ميشود. اين بيماري شايعترين اختلال متابوليكي در جهان است كه بسياري از افراد را درگير كرده است (1). ديابت را ميتوان به
70/ مجله علوم پزشكي دانشگاه آزاد اسلامي دو گروه اصلي تقسيم كرد كه شامل ديابت نوع 1 و ديابت نوع نوع 2 هستند. ديابت نوع 1 اختلالي است كه بر اثر تخريب خود ايمني سلولهاي مولد انسولين پانكراس به وجود ميآيد كه اين القاي خودايمني ممكن است در اثر عوامل ژنتيكي و محيطي به وجود آيد. ديابت نوع 2 بيماري متابوليكي پيچيدهاي است كه 95 درصد جمعيت ديابتي را در مقايسه با نوع 1 (كه 5 درصد است) تشكيل ميدهد (1). جايگزيني سلولهاي بتاي پانكراسي هدف درماني چندين دهه براي كاهش ميزان مرگ و مير و پيشرفت ديابت است. پيوند سلولهاي بتاي مولد انسولين به شكل پانكراس كامل يا جزاير لانگرهانس جداشده گزينه درماني اميدواركنندهاي براي درمان اين بيماري است (2). با اين وجود در حال حاضر چندين عامل مانع استفاده گسترده از اين روش درماني هستند و علت اصلي كمبود شديد بافتهاي دهنده متناسب با گيرندههاي واجد شرايط است (3). به همين دليل تلاشهاي تحقيقاتي زيادي براي توليد بافت توليدكننده انسولين جهت پيوند در مدلهاي انساني و حيواني انجام گرفته است. امروزه يكي از متداولترين روشها تمايز سلولهاي بنيادي/ پيش ساز بزرگسالان يا جنيني به سلولهاي بتاي پانكراسي مولد انسولين است (4). مطالعات جنين شناسي نشان ميدهند كه پانكراس منشا آندودرمي دارد. دو ميانكنش اصلي در تكوين بخش پشتي و شكمي پانكراس نقش دارند. پيامهاي اوليه ترشح شده از نوتوكورد باعث شروع ريختزايي پانكراس پشتي و بيان ژنهاي اوليه مانند PDX1 و lsl ميشوند كه در تكوين پانكراس نقش دارند و ديگري سيگنالهاي نهايي هستندكه از مزانشيم ترشح مي شوند و باعث تكوين هر دو ناحيه پشتي و شكمي و در نهايت ملحق شدن اين دو ناحيه به يكديگر ميشود (5). پانكراس در حال تكوين فاكتورهايي توليد ميكند كه باعث تمايز سلولهاي بنيادي به سمت سلولهاي توليدكننده انسولين ميشود. از جمله اين فاكتورها فاكتور شبه انسوليني IGFII) 2 (Insulin Like growth Factor II= بقا جزاير پانكراسي موش بالغ در كشت آزمايشگاهي فاكتور رشد عصب NGF) (Neural growth Factor= فاكتور رشد فيبروبلاستي Factor=FGF) (Fibroblastic growth اكتيوين A و رتينوي يك اسيد است كه ميتوانند به تمايز سلولهاي بتاي پانكراس كمك كنند (6). در طي تكوين و اندامزايي بدن آندودرم جلويي براي تشكيل جوانه پانكراس اختصاصي شده است. جوانههاي پشتي و شكمي كه از زايده اطراف روده جلويي حاصل شدهاند دچار درون روي شده و انشعابات اپيتليوم آنها تكثير يافته و وارد مزانشيمي كه آنها را احاطه كرده است ميشوند سلول هايي كه اطراف مزانشيم هستند با دريافت پيامهايي به سلولهاي بتا تمايز پيدا ميكنند و اين سلولها به سرعت در محيط كشت تكثير مييابند (7). تمايز سلولهاي بنيادي موش و انسان به سلولهاي اندوكرين پانكراس از سال 2000 شروع شد. Lumelsky در سال 2000 با مشاهده شباهت تكوين سيستم عصبي مركزي و پانكراس به منظور تمايز سلولهاي اندوكرين از روش تكوين سلولهاي عصبي ياري گرفت. از سال 2002 تا 2005 گروههاي مختلف با استفاده از بيان مداوم ژن PAX4 مهار كنندههاي مسير سيگنالي PIK3 تمايز خودبه خودي استفاده از محيطهاي غني سازي سلولهاي نستين مثبت و نستين منفي از سلولهاي بنيادي سلولهاي اندوكريني پانكراس را توليد كردند (8). با وجود اين هيچ يك از سلولهاي به دست آمده تمام نشانگرهاي سلولهاي انسولين ساز را بيان نميكردند. گروههاي مختلف پژوهشي با روشهاي گوناگون و با استفاده از فاكتورها و محيط- هاي مناسب تكوين پانكراس سعي در تمايز بهتر سلولهاي بنيادي به سلولهاي توليد كننده انسولين داشتند (10). يكي از تكنيكهاي مهم كه به منظور بهينه كردن هر چه بيشتر شرايط محيط كشت براي به دست آوردن سلولهاي بهتر و با كيفيتتر مورد تحقيق و توجه قرار گرفت استفاده از روش همكشتي است. در اين روش جزاير لانگرهانس و سلول بنيادي مورد نظر را به صورت هم زمان كشت داده كه با آزادسازي سيگنالهاي تمايز از سوي اين جزاير سبب القاي تمايز در سلول بنيادي ميشود (10). از آنجايي كه در روند تمايز از اين جزاير به روش همكشتي با سلولهاي بنيادي استفاده ميشود در اين مطالعه به نحوه استخراج و بررسي ميزان بقا و وضعيت اين جزاير در شرايط كشت آزمايشگاهي پرداختيم. مواد و روشها جداسازي جزاير لانگرهانس موش نر نژاد NMRI (در محدوده وزني -25 30 گرم) از مركز تحقيقات تكثير و نگهداري حيوانات دانشگاه علوم پزشكي جندي شاپور اهواز ) اهواز ايران) تهيه شد. نگهداري حيوانات مطابق با انستيتوي بين المللي سلامت انجام شد. حيوانات در شرايط استاندارد (2 ± 22 درجه سانتي گراد و نور كنترل شده تحت شرايط استاندارد 12 ساعت روشنايي و 12 ساعت تاريكي) با دسترسي به آب و غذاي كافي در خانه حيوانات دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي اهواز نگهداري شدند. جزاير لانگرهانس پانكراس موشهاي نر نژاد NMRI به وسيله روش
محمد نبيو ين و همكاران/ 71 تابستان 95 دوره 26 شماره 2 Lacy and Kostianovsky و به طريق روش هضم آنزيمي كلاژناز جدا شدند. پس از نخاعي كردن موش شكم حيوان باز شد مجراي صفراوي در انتهاي ديستال و نزديك به دوازدهه مسدود شد و 5 ميلي ليتر از محلول Hank s ) HBSS ( Merck, Germany) (Balanced Salt Solution حاوي: (115 Nacl, 10 NaHCO3, 5 Kcl, 1.1 Mgcl2, 1.2 NaH2P04, 2.5 Cacl2, 25 HEPES, 5D-glucose, PH=7.4, 1% BSA) (كه تمامي واحدها( mmol/l ( هستند) و 1/4 ميليگرم/ميلي ليتر كلاژناز IV (سيگما) به مجرا تزريق شد (13). پس از آن پانكراس به مدت 15 دقيقه در دماي 37 درجه حمام آب انكوبه شد. پس از آن 15 ميلي ليتر محلول سرد Hank s براي رقيق كردن غلظت كلاژناز و توقف روند هضم اضافه شد. براي شستن كلاژناز از بافتهاي جزاير لوله به مدت 2 دقيقه در 1200 دور در دقيقه سانتريفوژ شد و محيط رويي دور ريخته شد. شستن جزاير دوباره تكرار و باقي مانده به پتري ديش منتقل شد (13). جزاير به روش Handpicking و توسط استريوميكروسكوپ Holland) (Euromex, از هم جدا شدند و براي مدت يك شب در محيط RPMI-1640 (Gibco, USA) به همراه 10% FBS,100 U/ML penicillin, 100 U/mL streptomycin و 5 mm D-glucose و با 95% O2, 5% CO2 كشت داده شدند.(13 14) رنگآميزي ديتيزون (DTZ) به منظور تشخيص بافت جزاير لانگرهانس سلولهاي جزاير از رنگآميزي ديتيزون (Dithizone) استفاده شد. ديتيزون يك عامل متصل شونده به روي است كه به صورت انتخابي سلول- هاي بتاي پانكراس را به رنگ قرمز در ميآورد. زيرا اين سلولها داراي مقادير زيادي روي هستند. براي تهيه محلول ديتيزون 50 ميلي گرم ديتيزون (Merck) در 5 ميلي ليتر دي متيل سولفوكسيد sulphoxide) (Sigma) (Dimethyl حل و به عنوان محلول استوك در دماي 20 درجه سانتيگراد نگهداري شد. محلول رنگ آميزي از طريق يك فيلتر نايلوني فيلتر شد و پس از آن به عنوان محلول كار DTZ 0/2μm مورد استفاده قرار گرفت. در هنگام استفاده ديتيزون با غلظت نهايي 10 ميكرومولار به سلولها اضافه و به مدت 15 دقيقه در انكوباتور انكوبه شد. سلولهايي كه در نتيجه اين رنگ آميزي به رنگ قرمز درآمدند سلولهاي توليد كننده انسولين بودند. بررسي ميزان بقاي جزاير لانگرهانس با استفاده از تست MTT ميزان بقاي سلولهاي جزاير به وسيله روش رنگ سنجي (MTT) مورد آزمايش قرار گرفت. اساس اين تست شكسته شدن نمك زرد رنگ تترازوليوم توسط آنزيم سوكسينات دهيدروژناز ميتوكندريايي سلولهاي زنده و توليد بلورهاي بنفش رنگ و نا محلول فورمازان است. هرچه تعداد سلولهاي زنده بيشتر باشد شدت رنگ توليد شده نيز بيشتر خواهد بود. براي انجام اين تست تعدادي سلول در هر چاهك پليت 96 خانه كشت و به مدت 24 ساعت در انكوباتور قرار داده شدند. سپس محيط رويي خارج و هر چاهك دو بار توسط PBS شسته شد. سپس 100 ميكروليتر محيط كشت فاقد سرم به هر چاهك پليت اضافه و پليت به مدت 24 ساعت انكوبه شد. پس از آن محيط هر چاهك با 100 ميكروليتر محيط فاقد سرم تازه جايگزين شد (17 18). به هريك از چاهكها 0/5 mg/ml محلول (Dimethylthiazol-2-yl-2,5- MTT (Sigma) diphenyltetrazolium bromide) با غلظت 5 ميلي گرم بر ميلي ليتر اضافه و به مدت 4 ساعت در انكوباتور 37 درجه سانتيگراد انكوبه شد. سپس محيط رويي هر چاهك تخليه و به منظور حل شدن بلورهاي فورمازان 100 ميكروليتر دي متيل سولفوكسايد DMSO به هر يك از آنها اضافه و به مدت 2 ساعت در دماي اتاق و در مكاني تاريك قرار داده شد. سپس محتواي هر چاهك از پليت به يك چاهك ديگر منتقل و جذب نوري (OD) هر چاهك توسط ) Microplated Reader (BioRad Instruments USA در طول موج 570 نانومتر اندازه گيري شد (16 18). شمارش سلولها بلو براي بررسي تغييرات تعداد سلولهاي جزاير طي مدت 15 روز از روش شمارش سلولي با لام ني وبار استفاده شد. براي شمارش سلولي پس از تريپسينه كردن سلولها و تهيه سوسپانسيون سلولي 50 ميكروليتر از آن را برداشته و 50 ميكروليتر تريپان %0/4 به آن اضافه شد (فاكتور رقت 2 10 سپس.( 2 ميكروليتر از محلول فوق برداشته شد و به لام هموسيتومتر (ني وبار) در زير لامل منتقل شد. سلولهاي زنده به دليل سالم بودن غشاء سلولي از ورود رنگ به داخل جلوگيري ميكنند ولي سلولهاي مرده به رنگ آبي و با اندازه درشتتر مشاهده شدند. تحليل آماري دادهها توسط نرم افزار SPSS و به وسيله آزمون تحليل واريانس يكطرفه (ANOVA) و پساآزمون Tukey تحليل شدند. 0/05> P به عنوان اختلاف آماري معنيدار در نظر گرفته شد.
72/ مجله علوم پزشكي دانشگاه آزاد اسلامي بقا جزاير پانكراسي موش بالغ در كشت آزمايشگاهي شكل 1. سلولهاي جزاير لانگرهانس پانكراس جدا شده از موش. الف) بلافاصله پس از استخراج. در روز اول سلولها حالت كروي و شفاف دارند و به صورت معلق ديده ميشوند. ب) سلول هاي جزاير لانگرهانس استخراج شده چند روز پس از كشت وارد مرحله آپوپتوز مي شوند. شكل 2. تصويري از جزاير لانگرهانس كه با رنگ اختصاصي ديتيزون رنگ آميزي شده است. الف)گروه آزمايش: سلول هاي قرمز رنگ يا ديتيزون مثبت نشان دهنده جزاير لانگرهانس هستند. ب)گروه كنترل منفي: نمونه سلول هاي كنترل كه بدون رنگ آميزي هستند. يافتهها بررسي مورفولوژي جزاير سلولهاي جزاير لانگرهانس پانكراس از موش بالغ سوري نژاد NMRI به دست آمدند. اين سلولها داراي قابليت كشت در محيط مخصوص به خود و نگهداري در شرايط آزمايشگاهي هستند. در ابتداي استخراج سلولها كروي شكل با حاشيه مشخص و شفاف بودند كه به صورت شناور در ظروف كشت مشاهده شدند (شكل 1 -الف). با گذشت زمان حالت شفاف و روشن خود را از دست داده و تيره شده و كم كم از حالت تودهاي شكل خارج شدند كه نشان دهنده ورود به مرحله آپوپتوز است (شكل 1 -ب). بررسي رنگ آميزي DTZ براي اثبات اينكه تودههاي استخراج و كشت شده همان جزاير لانگرهانس هستند با رنگ ديتيزون رنگ آميزي شدند و بر اساس نتايج حاصل تقريبا تمامي تودههاي حاصله به رنگ قرمز خوني در آمدند كه تاييد كننده استخراج جزاير است (شكل 2 ). در روزهاي ابتدايي كليه جزاير رنگ آميزي شدند ولي با گذشت زمان شدت رنگ گيري جزاير نيز كاهش يافت.
محمد نبيو ين و همكاران/ 73 تابستان 95 دوره 26 شماره 2 بقاي جزاير لانگرهانس در شرايط كشت آزمايشگاهي جزاير لانگرهانس استخراج شده به مدت 15 روز در شرايط آزمايشگاهي كشت شدند و در روزهاي معيني از نظر ميزان بقا بررسي شدند. بر اساس نمودار 1 مي توان نتيجه گرفت كه در روزهاي آغازين (D1) ميزان حداكثري جذب در طول موج 570 نانومتر مشاهده شد كه حدودا 1/2 بود كه با گذشت زمان اين ميزان كاهش يافت به طوري كه در روز سوم (D3) ميزان جذب نزديك به 0/8 در روز ششم (D6) 0/6 در روز نهم (D9) نزديك به 0/4 و در روزهاي دوازدهم (D12) و پانزدهم( D15 ) به ترتيب 0/2 و 0/1 بود (نمودار 1). نتايج نشان ميدهد كه ميزان بقا و ماندگاري جزاير با گذشت زمان به طور معنيداري كاهش مييابد. بررسي تعداد سلولها با گذشت زمان با توجه به كاهش بقا تعداد سلول هاي جزاير نيز كاهش پيدا كرد. هر چه مدت زمان كشت افزايش مييافت از ميزان بقا و تعداد سلولها كاسته ميشد (نمودار 2). همان طور كه در نمودار 2 مشاهده ميشود در روزهاي آغازين پس از استخراج تعداد سلولها در حدود 10 1/2 6 بود و هرچه زمان نگهداري سلولها در محيط كشت افزايش مييافت تعداد سلولها كم ميشد به طوري كه در روز پانزدهم (D15) به حدود 10 2 5 عدد رسيد. نمودار 1. نمودار بقاي جزاير لانگرهانس. جذب سلولهاي جزاير پانكراسي در طول موج 570nm انجام گرفته است. بحث در اين پژوهش جزاير لانگرهانس موش بالغ جداسازي شد و بقا و تكثير آنها در شرايط آزمايشگاهي مورد بررسي قرار گرفت. نتايج حاصل از اين پژوهش نشان داد كه با گذشت يك هفته از استخراج جزاير ميزان از بقا و عملكرد آنها كاسته ميشود. از آن جايي كه محققين از اين جزاير براي درمان بيماري ديابت و در روش هم كشتي استفاده مي كنند بررسي ميزان بقاي اين سلول ها در شرايط محيط كشت ضروري به نظر ميرسد آيد. با توجه به محدوديتهاي موجود در درمان ديابت به نظر ميرسد استفاده از سلولهاي بنيادي بالغ و سلولهاي بنيادي جنيني كه توانايي تمايز به سلولهاي بتاي پانكراس را دارند ميتواند به عنوان روش درماني جديدي در نظر گرفته شود (10). تحقيقات نشان دادهاند كه تزريق عصاره پانكراس به حيوان ديابتي باعث كاهش موقت قند خون و كاهش ترشح قند در ادرار ميشود. تا به امروز تحقيقات بسياري در زمينه درمان ديابت صورت گرفته است و روشهاي درماني مختلفي در اين راستا پيشنهاد شده است. يكي از روشهاي درماني تمايز سلولهاي بنيادي به سلولهاي مولد انسولين از طريق هم كشتي با جزاير پانكراس است. از اين رو بررسي ميزان بقا و ميزان تكثير اين جزاير در شرايط آزمايشگاهي امري مهم و اجتناب ناپذير است.(11) تكوين سلولهاي بتا به مسيرهاي پيام رساني فاكتورهاي رونويسي تنظيم كننده تمايز سلول و فاكتورهاي ترشح شده از بافتهاي اطراف نياز دارد (12). چندين فاكتور ترشحي طي مراحل اوليه تكوين پانكراس ترشح ميشوند. از اين فاكتورها ميتوان رتينوي يك اسيد اكتيوين A و fgf را نام برد (18 و 13 ). مطالعات پژوهشي نشان دادهاند كه افزايش غلظت اكتيوين A باعث القاي بيان ژنهاي PDX-1 انسولين و گلوكاگون ميشود. اين فعال سازي به علت اثر مستقيم اكتيوين A در تحريك تمايز سلولهاي مزانشيمي پانكراس است ( 14 و 19). رتينوي يك اسيد براي القاي بيان ژن PDX-1 در جوانههاي آندودرمي پانكراس كافي است ( 15 و 20). به نظر ميرسد روش هم كشتي سلولهاي بنيادي با جزاير لانگرهانس فاكتورهاي لازم براي تكوين و تمايز به سمت سلول هاي بتا را تا حدود زيادي فراهم ميآورد پس ميتوان از روش هم كشتي به عنوان يك روش كارامد و مقرون به صرفه در شرايط آزمايشگاهي بهره گرفت. نمودار 2. شمارش سلولهاي جزاير در طي 15 روز
74/ مجله علوم پزشكي دانشگاه آزاد اسلامي بقا جزاير پانكراسي موش بالغ در كشت آزمايشگاهي Mansouri و همكارانش عصاره پانكراس موش صحرايي بالغ را روي تمايز سلول هاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان موش صحرايي به منظور بررسي تمايز سلول هاي انسولين ساز استفاده كردند. آنها با استفاده از رنگ آميزي ديتيزون سلول- هاي تمايز يافته و تمايز نيافته را از هم تميز دادند (17). در سلولهايي كه با غلظت 50 ميكرو گرم بر ميلي ليتر عصاره تيمار شده بودند تعداد سلولهاي قرمز رنگ اندكي ديده ميشد. به ترتيب هر چه بر ميزان عصاره افزوده شد تعداد سلولهاي قرمز رنگ بيشتري ديده شد. آنها مشاهده كردند كه در غلظت 200 ميكرو گرم بر ميلي ليتر تعداد سلولهاي قرمز رنگ بيشتر است و سلولهاي تمايز يافته بيشتري نسبت به سلولهاي گروه كنترل منفي مشاهده ميشود (17). Phillips و همكارانش در سال 2007 از تمايز سلولهاي بنيادي جنيني انساني (hesc) سلولهاي آندودرم پانكراسي را توليد كردند كه با توليد اجسام شبه جنيني در محيط كشت سه بعدي و در حضور Activin و Bmp4 سلولهاي اندودرم اوليه را به دست آوردند. اين فاكتورها زمينه مناسبي را براي رشد تكثير و تمايز سلولهاي hes به سلولهاي پانكراسي مهيا ميكنند (1). Karaoz و همكارانش در سال 2010 سلولهاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان را با سلولهاي جزاير لانگرهانس تحت شرايط استاندارد هم كشتي دادند و سپس با استفاده از روش ELIZA مشاهده كردند كه نسبت به نمونه كنترل ميزان ترشح انسولين افزايش يافت كه نشان دهنده آزاد شدن افزايش ميزان ترشح انسولين توليدي ميشود (3). به علاوه Kasahara و همكارانش در سال 2013 از سلولهاي بنيادي مزانشيمي در جهت فعال سازي جزاير لانگرهانس استفاده كردند و مشاهده كردند كه سيگنالهايي از سلولهاي بنيادي مزانشيمي ترشح ميشود كه توانايي فعال سازي جزاير در جهت ترشح انسولين را دارد (21). در همين راستا Wang و همكارانش در سال 2013 سلولهاي مزانشيمي مشتق از ژله وارتون بند ناف انسان را با سلولهاي پانكراس موشي هم كشتي دادند. نتايج حاصل از كار آنها نشان داد كه غلظت انسولين و C-Peptid در نمونه كنترل افزايش يافت. سپس اين سلولها را به موش مبتلا به ديابت تزريق كردند و سطح پاييني از گلوكز خون را در موش مشاهده كردند (21). با اين مطالعه ميتوان نتيجه گرفت جزاير لانگرهانس را ميتوان از پانكراس موش بالغ جدا كرده در محيط كشت و در زمان معين و محدودي نگه داري كرد. به علاوه اگر اين سلولها را به مدت 15 روز كشت دهيم در روزهاي آغازين پس از استخراج بقاي سلولها بيشتر است و با گذشت حدود يك هفته بقا و عملكرد آنها به حداقل ميرسد. از آنجايي كه اين جزاير در سلول درماني در جهت درمان ديابت استفاده ميشوند براي عملكرد بهتر اين سلولها در شرايط كشت آزمايشگاهي بايد به مدت زمان هم كشتي اين جزاير با سلولهاي ديگر دقت كرد. تشكروقدرداني سيگنالهاي تمايزي به وسيله جزاير لانگرهانس است كه بر نويسندگان اين مقاله از معاونت پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي تاثير ميگذارد (2). و خدمات بهداشتي درماني جندي شاپور اهواز كه امكان همچنين Bhaiji و همكارانش در سال 2012 سلولهاي رده اجراي اين طرح را فراهم كردند تشكر و قدرداني بسياري MIN6 بتاي پانكراس را با سلولهاي مزانشيمي هم كشتي ميكنند. دادند كه مشاهده كردند علاوه بر افزايش بقاي جزاير سبب REFERENCES 1. Philips BW, Henteze H, Rust WL, Chen QI, et all. Directed differentiation of human embryonic stem cells into the pancreatic endocrine lineage. J Stem Cells 2007;16:561-78. 2. Karaoz E, Genc Zs, Demircan Pc, Akson A, Duruksu G. Protection of rat pancreatic islet دfunctio and viability by coculture with rat bone marrow-derive mesenchymal stem cells. J Cell Death 2010;9:17-23. 3. Bhaiji T, Zhi ZL, Pickup JC. Improving cellular function and immune protection via layer-by-layer nanocoating of pancreatic islet b-cell spheroids cocultured with mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res 2012;100:1628-36. 4. Karaoz E, Ayhan S, Kcu A, Aksoy A. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells co-cultured with pancreatic islets display β cell plasticity. J Tissue Eng Regen Med 2011;5:491-500. 5. Murry CE, Keller G. Differentiation of Embryonic stem cells to clinically relevant populations lessons from embryonic development. Cell 2008;132:661-80. 6. Li P, Tong C, Mehrian-Shai R, Jia L, Wu N, Yan Y, et al. Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts. Cell 2008;135:1299-310.
محمد نبيو ين و همكاران/ 75 تابستان 95 دوره 26 شماره 2 7. Buehr M, Meek S, Blair K, Yang J, Ure J, et al. Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts. Cell 2008;135: 1287-98. 8. Xu X, Browning VL, Odorico JS. Activin, BMP and FGF pathways cooperate to promote endoderm and pancreatic lineage cell differentiation from human embryonic stem cells. Mech Dev 2011;128:412-27. 9. Borowiak M, Maehr R, Chen S, Cheno AE, Tang W, Fox JL. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2009;4:348-58. 10. Smukler R, Arntfeild E, Razavi R, Bikopoulos G, Karpowicz Ph, Seaberg R. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell 2011;8:281-293. 11. Bar-Nur O, Russ AH, Efrat Sh, Vensity B. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell 2011;9:17-23. 12. Murtaugh CL. Pancreas and beta-cell development: from the actual to the possible. Development 2007;134:427-38. 13. Friel R, Van der sar S, Mee PJ. Embryonic stem cells: Understanding their historycell biology and signalling. Adv Drug Deliv Rev 2005;1894-903. 14. Conley BJ, Young JC, Trounson AO, Mollard R. Derivation. propagation and differentiation of human embryonic stem cells. Int J Biochem Cell Biol 2004;36:555-67. 15. Spence JR, Wells JM. Translational embryology: Using embryonic principles to generate pancreatic endocrine cells from embryonic stem cells. Dev Dyn 2007;236:3218-27. 16. Segev H, Fishman B, Ziskind A, Shulman M, Itskovitz J. Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters. Stem Cell 2004;22:265-74. 17. Mansouri-Bidekani A, Esmaeili F, Houshmand F, Hajisharifi Z. Evaluation of pdx-1 gene expression in insulin producing cells, derived from embryonal carcinoma stem cells. J Shahrekord Univ Med Sci 2013;15:91-102. [In Persian] 18. Jafary H, Larijani B, Farrokhi A, Pirouz M, Mollamohammadi S, Baharvand H. Differential effect of activin on mouse embryonic stem cell differentiation in insulin-secreting cells under nestin-positive selection and spontaneous differentiation protocols. Cell Biolo Int 2008;32:278-86. 19. Mfopou JK, Geeraerts M, Dejene R, Van LS, Aberkane A, Van Grunsven LA, et al. Efficient definitive endoderm induction from mouse embryonic stem cell adherent cultures: A rapid screening model for differentiation studies. Stem Cell Res 2014;12:166-77. 20. Scuteri A, Donzelli E, Rodriguez V, Ravasi M, Monfrini M,. Bonandrini B, et al. A double mechanism for the mesenchymal stem cells positive effect on pancreatic islets. PLoS One 2014;9:e84309. 21. Kasahara N, Teratani T, Doi J, Iijima Y, Maeda M, Uemoto Sh, et al. Use of mesenchymal stem cell-conditioned medium to activate islets in preservation solution. Cell Med 2013;5:71-85. 22. Wang G, Li Y, Wang Y, Dong Y, Wang FS, Ding Y, et al. Roles of the co-culture of human umbilical cord Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells with rat pancreatic cells in the treatment of rats with diabetes mellitus. Exp Ther Med 2014;8:1389-96.